漸漸習慣了現代生活的美國隊長史蒂夫·羅傑斯(克裡斯·埃文斯 Chris Evans 飾),在一次行動後隱隱嗅到神盾局內部所彌漫出來的兇險氣味。而當得知神盾局正秘密進行的“洞察計劃”後,他更為此感到憤怒。某天,神盾局指揮官尼克-法瑞(塞繆爾·傑克遜 Samuel L. Jackson 飾)遭到一群武裝分子襲擊,他拼盡全力將一支U盤交到美國隊長手中,這裡面藏著該局二戰以來最重要且最可怕的秘密。在此之後,美國隊長因涉嫌殺害尼克而遭到前局長亞歷山大·皮爾斯(羅伯特·雷德福/Robert Redford 飾)的通緝和追殺,逃亡中他得到黑寡婦(斯嘉麗·約翰遜 Scarlett Johansson 飾)和退伍老兵“獵鷹”(安東尼·麥凱 Anthony Mackie 飾)的幫助。他們必須爭分奪秒解開神盾局的秘密,阻止“洞察計劃”的施行……
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